microRNA及自噬对心肌重构的调控作用

【摘要】目的：心力衰竭是多种心血管疾病的终末期表现,是指在静脉回流正常的状态下,由于心脏的舒张和／或收缩功能发生障碍,导致心脏排血量不能满足组织器官代谢需要的一种综合症。尽管有很多心力衰竭的治疗药物和治疗方法治疗心力衰竭,但是该病的5年生存率仍然很低。各种心血管疾病首先引起的心肌代偿性肥厚,在长期的致病因素作用下,心脏功能逐渐失代偿,并逐渐发展为心力衰竭。在心力衰竭发病的过程受到多种编码及非编码基因的调控,但是至今很多基因及其调控作用机制尚不清楚。MicroRNA(miRNA)是一类细胞内有调控作用的小分子RNA,通常由21-23个核苷酸组成。近期研究表明,在多种心血管疾病中miRNA均参与心脏功能和心肌重塑的调控。我们研究组前期体外研究结果表明miR-221是一种促肥厚因子。在原代培养的新生大鼠心肌细胞中过表达miR-221诱导心肌肥厚。然而,miR-221是否能在体内条件下调控心肌重塑,以及miR-221调控心肌重塑的机制尚不清楚。因此,本研究通过构建miR-221心肌特异转基因小鼠,探讨miR-221在心肌重塑中的作用及机制,旨在为阐明心力衰竭的调控机制以及提供新的治疗靶点提供实验依据。方法与结果：为探讨miR-221在体内条件下是否调控心脏功能及心肌重塑,本研究成功构建了心肌特异miR-221转基因小鼠模型。4周龄miR-221转基因小鼠与同窝阴性组小鼠相比心脏体积显著增加,心脏／体重比值增大。实时定量PCR结果表明,4周龄的miR-221转基因小鼠与同窝阴性对照小鼠相比,心脏胚胎基因ANP及BNP的表达显著上调。Masson三色染色显示,miR-221转基因小鼠心肌纤维化程度增加。同时,TUNEL染色结果显示,miR-221转基因小鼠心肌细胞凋亡数目增加。M型超声心动图显示,miR-221转基因小鼠表现为左室后壁增厚、左室内径增大、射血分数降低及短轴缩短率降低。上述结果表明,心肌特异过表达miR-221诱导心室肌重构、心功能衰竭。为进一步研究miR-221诱导心力衰竭的分子机制,我们采用电子显微镜观察miR-221转基因小鼠心肌细胞超微结构的变化。结果显示,miR-221转基因小鼠心肌细胞内出现大量聚集的空泡状结构、受损线粒体数目增多。Westenn印迹检测结果证实,在miR-221转基因小鼠心肌组织以及miR-221过表达原代新生大鼠心肌细胞内自噬标记蛋白LC3脂化型LC3-Ⅱ水平均被下调,而p62蛋白则呈相反变化。将编码EGFP-LC3融合基因的质粒pEGFP-LC3与miR-221类似物共转染H9c2,采用激光共聚焦显微镜观察自噬体形成。镜下可观察到过表达miR-221的心肌细胞自噬体数目显著减少。上述结果共同表明,miR-221显著抑制心肌细胞自噬。mTOR是自噬调控的关键分子。我们发现,4周龄的miR-221转基因小鼠的心肌组织内mTOR通路被激活。同样,在miR-221过表达的新生大鼠心肌细胞内,mTOR呈现相同趋势。为进一步验证mTOR通路的激活与miR-221诱导的心肌肥厚及自噬抑制有关,我们使用mTOR通路的特异性抑制剂雷帕霉素处理新生大鼠心肌细胞。结果表明,使用雷帕霉素(20nM)预处理的心肌细胞可以显著阻断miR-221诱导的心肌肥厚及自噬抑制。因此提示,mTOR信号通路在miR-221诱导的心力衰竭及自噬抑制中起到关键性的调控作用。p27是miR-221的已知靶点,在miR-221转基因小鼠心肌组织内,我们观察到p27的表达被显著下调。采用siRNA靶向性干扰p27基因表达。与过表达miR-221类似,敲低p27后同样引发心肌细胞自噬抑制和mTOR通路的激活。p27可与细胞周期依赖性激酶2(cyclindependentkinase2,CDK2)特异性结合并抑制其功能。采用CDK2的选择性抑制剂SU9516显著抑制miR-221诱导的自噬抑制和心肌肥厚。表明CDK2在miR-221诱导的心肌肥厚及自噬抑制中有关键的调控作用。结论：综上所述,miR-221可通过调控p27/CDK2/mTOR通路介导的自噬抑制诱发心力衰竭。我们的研究结果表明,miR-221是心肌细胞内自噬调控的关键因子,miR-221可能是心力衰竭治疗的潜在靶点。目的：各种心血管疾病如高血压、主动脉畸形等可以导致心脏的继发性肥厚。而肥厚型心肌病(Hypertrophiccardiomyopathy,HCM)是一种以左心室渐进性增厚为主要特点的原发性心肌病。其主要病理变化为左心室肥厚、心肌细胞排列紊乱和心肌间质纤维化。部分HCM患者有猝死和发展为心力衰竭的危险。因此,HCM对人类健康产生巨大威胁。HCM多是由于编码心肌细胞内肌小节蛋白的基因发生突变所引起的一种常染色体显性遗传病。尽管目前已经发现并确认十余种可以直接导致HCM的致病基因。但是,促进HCM患者心肌肥厚的分子机制并不清楚。越来越多的研究证实,微小RNA(microRNA,miRNA)参与并调控多种心血管疾病导致的心肌重塑过程。然而,miRNA在HCM中的作用并清楚。基于在其他心血管疾病中的研究结果,我们推测miRNA在HCM中也起到至关重要的调控作用。因此本研究采用miRNA微阵列筛选HCM中起主要变化的miRNA,并验证其在调控心肌细胞中的作用机制,旨在为揭示HCM发生发展过程的分子机制及治疗靶点提供实验依据。方法与结果：为了筛选出HCM患者心肌组织中起主要调控作用的miRNA,我们随机选取了7例HCM患者和5例健康供体组织。提取总RNA后采用miRNA微阵列筛选差异表达基因。结果显示,有3个miRNA在HCM患者心肌组织中表达上调(≥2fold,P<0.01),10个miRNA在HCM患者心肌组织中表达下调(≤0.5fold,P<0.01)。其中,miR-451是下降程度最多的miRNA之一。之后,我们随机选取了16例HCM患者心肌组织和8例健康供体心肌组织,使用实时定量PCR的方法验证miR-451的表达水平。与miRNA微阵列结果一致,miR-451的表达在HCM患者心肌组织中下调4倍以上(P<0.01)。为了验证miR-451对心肌肥厚的调控作用,我们用miR-451类似物或抑制物转染体外培养的原代新生大鼠心肌细胞。结果发现,过表达miR-451可以降低心肌细胞表面积,而用miR-451抑制物敲低内源性miR-451则导致心肌细胞表面积增大。双荧光素酶报告系统结果显示,TSC1是miR-451的直接靶点。在体外培养的原代新生大鼠心肌细胞及HeLa细胞中过表达miR-451可以显著抑制TSC1的表达水平。此外,在HCM心肌组织中TSC1处于高表达状态,这与HCM心肌组织中miR-451的下调相一致。因TSC1是一个已知的自噬激活蛋白,我们将编码EGFP-LC3荧光融合蛋白的质粒与miR-451类似物及其对照或miR-451抑制物及其对照共转染入HeLa细胞。在激光共聚焦显微镜下可见过表达miR-451组HeLa细胞自噬体数目减少,而抑制miR-451组自噬体数目增多。同时,Western印迹结果显示,转染了miR-451类似物的原代新生大鼠心肌细胞自噬标志蛋白LC3脂化型LC3-Ⅱ水平降低。相反,敲低内源性miR-451的原代新生大鼠心肌细胞自噬标志蛋白LC3脂化型LC3-Ⅱ水平升高。电镜下可见,HCM患者心肌细胞内自噬体数目增多。Western印迹结果显示,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平增高,而自噬抑制蛋白Bcl-2表达下调。这些结果提示,miR-451抑制心肌细胞自噬,并参与心肌重塑的调控过程。结论：综上所述,我们的研究表明miR-451可以调控心肌肥厚,并可以通过靶向抑制TSC1的表达抑制心肌细胞自噬。HCM患者心肌组织中miR-451显著下调,这可能参与HCM患者心肌重塑的病理过程和自噬调控。因此,miR-451可能是HCM治疗的新靶点。目的：修饰基因参与调控肥厚型心肌病(HCM)的临床表现。肌肉环指状(MuRF)蛋白是一类肌肉特异性的泛素E3连接酶。这类蛋白参与并调控心脏发育和功能。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)是细胞内降解蛋白的途径之一。已有研究表明,HCM心脏组织中UPS功能被减弱,从而导致编码肌小节蛋白的突变基因降解减少,加快HCM疾病的进展。由MuRF1、MuRF2和MuRF3组成的环状指E3泛素连接酶亚家族特异性表达于横纹肌中。最近有研究表明,编码MuRF1的基因可以通过破坏心肌细胞蛋白质降解而导致HCM的发生,提示编码MuRF蛋白的基因发生变异可能参与HCM疾病的进展。因此,本研究通过高通量二代测序的方法,分别在HCM患者及健康对照中对MuRF亚家族三个成员,MuRF1,MuRF2和MuRF3的编码外显子进行深度测序,探讨MuRF1、MuRF2和MuRF3基因突变与HCM的关系。方法与结果：在本研究中,包含有594个无亲缘关系的HCM患者和307个健康对照。对MuRF亚家族中三个成员MuRF1、MuRF2和MuRF3的全部外显子进行二代测序。通过Sanger毛细管测序法确认筛选出的罕见变异。结果发现,在HCM患者中MuRF1和MuRF2基因罕见变异出现的频率较对照组升高(MuRF113/594[2.2%]versus1/307[0.3%],P=0.04;MuRF222/594[3.7%]versus2/307[0.7%];P=0.007)。携带有MuRF1和MuRF2罕见变异的HCM患者年龄较无变异的HCM患者年龄更小(P=0.04),并且有更高的最大左室壁厚度(P=0.006)。相反,HCM患者和健康对照中MuRF3罕见变异携带率无统计学差异。PolyPhe2SIFT生物信息学分析结果表明,21个MuRF1和MuRF2罕见变异有潜在的致病性。这些变异中有18个存在于22个HCM患者中(3.7%),而仅有3个存在于对照组中(1%,P=0.02)。在34个携带有MuRF1和MuRF2罕见变异的HCM患者中,有19个存在编码肌小节蛋白的基因发生突变(55.9%)。这些结果提示,MuRF1和MuRF2罕见变异与HCM的高外显率和临床表现的严重程度有关。结论：我们的研究结果证实MuRF1和MuRF2罕见变异与HCM的临床表现和严重程度有关。MuRF1和MuRF2罕见变异是HCM的修饰基因,UPS失调参与并加快HCM疾病的进展。
【作者】苏明；
【导师】惠汝太；
【作者基本信息】北京协和医学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】microRNA-221；心力衰竭；自噬；p27；mTOR；CDK2；肥厚型心肌病；microRNA-451；TSC1；microRNAs微阵列；肌肉指环状蛋白；罕见变异；修饰基因；

【参考文献】
[1]王红叶.基于尺度不变特征变换的虹膜识别方法[D].吉林大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[2]尹训彦.水泥窑低温余热发电热力系统分析与设计[D].大连理工大学,动力工程（专业学位）,2013,硕士.
[3]牛忠华.导航数据处理器的软硬件设计及实现[D].西安电子科技大学,电路与系统,2010,硕士.
[4]俞雷.经纬交织的艺术[D].西安美术学院,设计艺术学,2014,硕士.
[5]朱剑松.成灌快速铁路社会经济效益评价研究[D].西南交通大学,交通运输规划与管理,2011,硕士.
[6]苗红果.《人民日报》中的韩国国家形象呈现（2007-2012）[D].吉林大学,新闻学,2013,硕士.
[7]刘志文.车身用复杂铝合金型材弯曲成形工艺及回弹控制研究[D].湖南大学,材料加工工程,2012,硕士.
[8]胡思行.我的美，由你来发现[D].浙江大学,新闻与传播（专业学位）,2013,硕士.
[9]杨婧婷.产业资本和金融资本融合模式选择分析[D].山东财经大学,企业管理,2013,硕士.
[10]王亭.基于rDNA序列研究土生空团菌的遗传多样性[D].内蒙古农业大学,植物病理学,2013,硕士.
[11]胡月明.高绩效工作系统与企业绩效关系的实证研究[D].扬州大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[12]张永斌.刚柔耦合配气机构动力学仿真及整机数字化样机建立[D].江苏科技大学,轮机工程,2013,硕士.
[13]宋戈.基于学习型组织建设的知识共享问题研究[D].电子科技大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[14]鞠成晓.大连市房地产周期性波动问题研究[D].东北财经大学,统计学,2003,硕士.
[15]李旸.中国服务贸易国际竞争力评价与对策分析[D].山西财经大学,国际贸易学,2014,硕士.
[16]谢敏.战略性改造背景下株洲市清水塘工业区企业迁移研究[D].湖南师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[17]常芳.潮州刺绣艺术及其在礼服设计中的应用研究[D].广东工业大学,服装与纺织品设计,2013,硕士.
[18]张峰龙.黑龙江省庆安县庆安镇新建水源地地下水资源评价与研究[D].吉林大学,水利工程,2013,硕士.
[19]邵艳玲.基于子空间的人脸识别算法研究[D].河南科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[20]车小强.抗菌性牙科光固化复合树脂的制备及表征[D].兰州大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[21]臧慧群.印度的“中国威胁论”评析[D].辽宁大学,国际关系,2012,硕士.
[22]赫磊.基于云平台的智慧旅游信息推送系统研究[D].西安工业大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[23]姚吟月.网络舆论监督的现状、问题及对策[D].南京师范大学,新闻学,2012,硕士.
[24]李慧.钢背/碳织物增强复合材料界面结合机理与强化研究[D].广东工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[25]张小翠.三种腹毛目纤毛虫射出胞器的显微、亚显微结构研究[D].华东师范大学,动物学,2014,博士.
[26]张璨.论我国人大人事任免听证制度的构建[D].苏州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[27]赵财霞.从目的论看畅销书的“众包”翻译模式[D].华中师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[28]何振峰,杭小树,熊范纶.一种基于时间窗口的数据预处理算法[J].小型微型计算机系统,2004,01:89-92.
[29]常发亮,刘长有.自动化立体仓库拣选出库总体调度策略的优化研究[J].控制与决策,1995,06:568-572.
[30]尹虹燕.农村资金互助社法律制度研究[D].湖南师范大学,经济法学,2013,硕士.
[31]郑金龙.黄连混合生物碱转化为单体巴马汀的研究[D].长春工业大学,化学工程,2013,硕士.
[32]雷中林.铁路路网系统运输能力理论与计算方法研究[D].北京交通大学,2006.
[33]段金娜.加味清心莲子饮治疗2型糖尿病（气阴两虚夹湿证）的临床研究[D].成都中医药大学,中医内科学,2012,硕士.
[34]郑和平.带电作业仿真培训系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[35]宋林郁.MAS在采购管理IDSS中的应用研究[D].武汉理工大学,2005.
[36]叶震.基于突发事件下的不同可靠性指标融合的路网可靠性分析[D].长安大学,交通工程,2014,硕士.
[37]郭东东.我国上市公司应收帐款及其相关问题的研究[D].吉林大学,工商管理,2004,硕士.
[38]刘子成.利用3S技术评价辽宁仙人洞国家级保护区金雕潜在悬崖巢址适宜度[D].辽宁大学,生态学,2012,硕士.
[39]张飞翔.被动式DMFC气泡行为的实验研究和数值模拟[D].浙江工业大学,化学工程,2012,硕士.
[40]张峤.基于远程通信的网络安全协议的研究[D].太原科技大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[41]顾钧.支持组件的数字媒体中间件技术研究[D].华中科技大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[42]葛启斌.违反行政程序表现形态及法律后果之比较分析[D].苏州大学,法律,2003,硕士.
[43]汪斐.无因管理制度研究[D].沈阳师范大学,民商法学,2013,硕士.
[44]方玉亮.NVST焦点探测[D].中国科学院研究生院（云南天文台）,天文技术与方法,2014,硕士.
[45]贺颖.音乐作品与音乐作品概念的历史及其感性—审美经验问题研究[D].上海音乐学院,艺术哲学与批评,2014,博士.
[46]张丽霞.论红色旅游的思想政治教育功能[D].辽宁大学,思想政治教育,2012,硕士.
[47]刘魁.基于胜任力的出版企业营销经理绩效评估方法研究[D].湘潭大学,工商管理,2011,硕士.
[48]杨建平.企业如何正确实施客户关系管理[J].未来与发展,2004,06:49-51+44.
[49]王刚金.塑料连栋温室夏季降温和主控因子研究[D].浙江大学,农业生物环境与能源工程,2004,硕士.
[50]张列平.带有限幅的速度调节器的参数选择[J].冶金自动化,1982,03:30-35.